آنتی بادی اولیه پس از اتصال به آنتی ژن صحیح به شدت به آن متصل شده و سپس انتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل می گردد. آنتی بادی ثانویه متصل به فلروکروم HRP است که اگر در معرض DAB قرار گیرند تولید رنگ قهوه ای رنگ می کنند.